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| IHC信號微弱/無信號 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 抗體效力 | a. 抗體效價不高。可通過增加抗體使用濃度，延長抗體孵育時間進行調(diào)整。 b. 所用抗體不適用于IHC實驗。建議在非變性WB上測試該抗體，以確保抗體識別非變性抗原，或是選用通過IHC實驗驗證的抗體。 c. 一抗二抗不匹配。使用針對一抗物種來源的二抗，如一抗宿主為rabbit，則須使用anti-rabbit的二抗。 d. 抗體失活。避免將標(biāo)記熒光基團的二抗放置于光照環(huán)境。 |
| 酶底物失活或呈色時波長設(shè)置錯誤 | a. 顯色溶液失去作用，可能是由于底物緩沖液中含有酶抑制劑，或底物緩沖液的pH值不適當(dāng)。建議取一滴二抗標(biāo)記酶與底物溶液反應(yīng), 可確認(rèn)顯色溶液是否失去活性。 b. 錯誤的激發(fā)波長。呈色前確保激發(fā)波長與使用的熒光基團相匹配。 |
| 樣品制備問題 | a. 脫蠟作用不足。建議延長脫蠟時間，使用新鮮配制的二甲苯。 b. 固定液（福爾馬林或 PFA) 可能改變表位。建議利用抗原修復(fù)方式使表位暴露出來或縮短固定作用的時間。 c. 固定作用不適當(dāng)。避免延遲固定或過度固定，一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數(shù)實驗應(yīng)用。 d. 冰凍切片樣品保存期過長。冰凍切片制備完成后，最好于1-2個月內(nèi)用完，超過6個月的話，建議制備新的玻片。 e. 熒光染色樣品保存不當(dāng)。熒光基團在光線下暴露時間過長，可能會導(dǎo)致信號減弱，建議在避光環(huán)境下進行實驗和保存樣品，也可使用防熒光淬滅的封片劑封固樣本。 |
| 樣品屬性 | a. 靶蛋白含量低。建議設(shè)置為陽性対照組，增加抗體使用量或利用放大步驟來放大信號。 b. 靶蛋白為核蛋白而抗體不能穿透細(xì)胞核。建議在封閉溶液與抗體稀釋液中加入滲透試劑，以促進抗體滲透到細(xì)胞內(nèi)。 c. 靶蛋白為膜蛋白而表位可能因為滲透作用被破壞或移除。建議將緩沖液中的滲透試劑減少或移除。 d. 較厚的組織。如斑馬魚全胚胎或染色建議做細(xì)胞破膜，以便抗體順利進入胞內(nèi)與相應(yīng)抗原結(jié)合。 關(guān)鍵步驟：在每次的實驗中，設(shè)置陽性與陰性對照組，以確認(rèn)是該次實驗的抗體、試劑、組織切片、實驗過程的問題，還是靶蛋白自身表達(dá)量低的問題。 |
| IHC非特異性染色/背景值比較高 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 固定方式或組織自身可能存在自發(fā)熒光 | a. 嘗試用非醛類替代醛類。 b. 用淬滅自發(fā)熒光的染料或方法處理組織樣品：如硼/氫/化/鈉、短波長的UV照射、蘇丹黑等。 c. 將石蠟包埋樣品的方法換成冰凍切片（OCT或明膠），減少固定液的影響。 d. 選擇不會與自發(fā)熒光競爭的熒光染料。福爾馬林、PFA或戊二醛等會產(chǎn)生高背景的熒光，尤其在使用綠色、藍(lán)色和紅色波長光譜范圍時；組織中的紅細(xì)胞或膠原蛋白等組分會產(chǎn)生很強的自發(fā)熒光，尤其是使用綠色和紅色通道的熒光檢測時。 e. 組織沖洗不*，有固定液殘留。 f. 使用福爾馬林或PFA固定過久。一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數(shù)實驗應(yīng)用，注意：如固定時間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中，否則有可能造成蛋白交聯(lián)無法修復(fù)。 g. 配置新鮮的固定液 |
| 封閉、洗脫或顯色問題 | a. 增加封閉液濃度、延長封閉時間。 b. 更換封閉液成分，注意: 封閉液成分不可與一抗物種同來源，最好與二抗物種同源，如二抗來自馬血清，使用馬血清可得到較干凈的背景。 c. 底物過量：縮短底物孵育時間。 d. 信號過度放大：縮短信號放大試劑孵育時間。 e. 洗脫液不適合：如果原本是用PBS，可更換使用TBS |
| 抗體濃度太高或非特異性結(jié)合 | a. 降低抗體濃度，如1：100調(diào)整為1：1000。 b. 縮短抗體孵育時間，并在4°c 孵育。 c. 增加封閉緩沖液濃度。 d. 做多個目標(biāo)蛋白染色時，建議使用預(yù)吸附二抗減少與其他物種一抗的交互作用。 e. 針對二抗與組織發(fā)生非特異性結(jié)合的情況建議每次實驗都要設(shè)置一組不加一抗，只加二抗的對照組，才能確認(rèn)信號是來自高背景值還是真實信號。 |
| 內(nèi)源性酶（過氧化氫酶或堿性磷酸酶） | a. 使用酶抑制劑。 - 過氧化物酶：使用H2O2 (0.3% v/v) - 堿性磷酸酶：使用 Levamisol (2 mM) |
| 內(nèi)源性生物素 | 與 Avidin 孵育以封閉生物素 |
| 組織問題 | a. 脫蠟不*，可能導(dǎo)致細(xì)胞核染色在呈相時模糊，亦可能導(dǎo)致抗體無法辨認(rèn)抗原或者高背景值。 b. 抗原修復(fù)方式不適合，建議更換修復(fù)溶液成分或方法。 c. 一抗與組織物種同源。較常發(fā)生在使用鼠源抗體染鼠源組織時，除了避開同樣物種來源的一抗和組織之外，也可以使用 Mouse-on-Mouse IHC染色試劑盒 (GTX83396) 迸行實驗。 d. 任何時候都不要讓組織干掉。 |
| IHC實驗結(jié)果形態(tài)不佳 | |
| 問題 | 解決方案 |
| 組織切片從載玻片上脫落 | a. 使用新鮮配制、適當(dāng)帶電或疏水處理過的載玻片。 b. 石蠟切片貼于載玻片后，于60°C烘烤3-5小時較為合適，烘烤不足容易掉片。 c. 實驗過程中要輕柔沖洗載玻片上的組織。 |
| 組織切片撕裂、褶皺或有氣泡 | a. 切片刀鈍或是刀刃上有缺口。建議使用鋒利刀片重新制備切片。 b. 刀刃上有蠟屑的積留，請隨時將廢屑?xì)堅妹⑶宄蓛簟?/span> c. 刀沒夾緊或刀的角度傾斜。適當(dāng)調(diào)節(jié)切片刀的角度，并確認(rèn)刀片和蠟塊都有夾緊。 d. 移動刀座，如果劃痕還是出現(xiàn)在相同位置，應(yīng)該是組織標(biāo)本內(nèi)有污物或硬物的問題。 e. 確認(rèn)組織無過度脫水，并調(diào)節(jié)適當(dāng)切片速度。 f. 在分析實驗結(jié)果時，避免損壞切片區(qū)域。 g. 避免展片時于載玻片上形成的氣泡。 |
| 組織形態(tài)分辨率差 | a. 制備較薄的切片。一般來說，冰凍切片的片子較厚（約10-30 um），一般設(shè)定刀片溫度為-10~-20度，如設(shè)定溫度太低，可能會切不好；石蠟切片的片子較薄（約5-10 um）。 b. 確認(rèn)已使用適當(dāng)厚度的蓋玻片，如使用油鏡一定要滴油。 c. 建議使用激光共聚焦顯微鏡成像，去除非焦點平面的噪質(zhì)。 |
| 固定不*或造成物理損傷 | a. 增加固定時間。如使用4 % PFA，一般建議至少固定6小時以上，18~24小時已可滿足大多數(shù)實驗應(yīng)用，可依據(jù)染色結(jié)果增加固定時間與/或加入后固定的步驟。注：如固定時間到了無法繼續(xù)后續(xù)脫水、包埋程序，一定要將組織置換到PBS保存，切勿一直泡于固定液中。 b. 增加固定液/組織比例，建議固定液體積至少要是組織塊的20倍體積。 c. 準(zhǔn)備較小的組織塊（約3-4 mm），以迸行更*的浸潤固定。 |
| 抗原修復(fù)過于強烈 | a. 憑經(jīng)驗決定保留組織型態(tài)的條件，同時恢復(fù)抗原的免疫反應(yīng)性。理論上溫度越高，酸堿值越堿，但可能造成較高的背景值或組織型態(tài)破壞，因此，建議從92°C, pH 6開始嘗試，pH 6的抗原修復(fù)液即適用于大多數(shù)抗體。 b. 使用冰凍切片樣本。冰凍切片一般不做抗原修復(fù)，因為抗原修復(fù)方式對冰凍切片可能太過強烈，也不需脫蠟、覆水等步驟，能夠較完好地保存細(xì)胞膜表面和細(xì)胞內(nèi)多種酶活性以及抗原的免疫活性。 |
| 切片組織細(xì)胞形成冰晶 | a. 防止組織中冰晶形成： -速凍使組織溫度驟降, 減少冰晶的形成。 -固定后將組織置于20％～30％蔗糖溶液1～3天，利用高滲吸收組織中水分, 減少組織含水量，可防止或減少冰晶的形成。 |
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